Левомицетин является антибиотиком широкого спектра действия; эффективен в отношении многих грамположительных кокков (гонококков и менингококков), различных бактерий (кишечная и гемофильная палочки, сальмонеллы, шигеллы, клебсиеллы, серрации, иерсинии, протей), риккетсий, спирохет и некоторых крупных вирусов. Препарат активен в отношении штаммов, устойчивых к пенициллину, стрептомицину, сульфаниламидам. Слабоактивен в отношении кислотоустойчивых бактерий, синегнойной палочки, клостридий и простейших.
Действует бактериостатически. Механизм антибактериального действия связан с нарушением синтеза белков микроорганизмов.
Лекарственная устойчивость к препарату развивается относительно медленно, при этом, как правило, перекрестной устойчивости к других химиотерапевтическим средствам не возникает.